Plasmid DNA 추출실험

plasmid DNA purificaton  <— 영문 메뉴얼

아래 글은 영문메뉴얼에서 주요 실험부분을 번역한 것입니다. 용어 선택 및 약간의 오역이 있을 수 있습니다.

Exprep™ Plasmid urification Kit

Exprep™Plasmid Kit는 박테리아세포로부터 소규모의 plasmid DNA를 준비할 수 있는 쉽고 빠른 방법을 제공한다. 이 kit는 어떠한 plasmid도 분리하고 정제할 수 있지만 plasmid가 20kb보다 작을 때 가장 효과적이다. 순수한 plasmid를 준비하는 모든 과정은 25분 정도 걸리며 다양한 샘플들을 동시에 수행할 수 있다. 30ug까지의 순수한 plasmid는 mini kit로 정제될 수 있고 이 순수한 plasmid DNA는 더 이상의 조작 없이 PCR, 형광의 연속, 분류된 교배조사의 합성, 세포교환, 전기 천공법, 제한효소분석에 사용된다.

 -방법의 원리

Exprep™Plasmid Kit는 한정된 알칼리성 용해방법에 기초한 유리 극세사 막을 활용한다. 알칼리성 용해는 박테리아의 세포로부터 온 plasmid DNA을 방출하고 RNA을 저하시키고 Rnase 용해물 안에 살아있는 어떠한 RNA라도 지운다. 세포의 잔해와 나트륨침전물은 mini kit에 원심분리에 의해 제거된다.

나트륨 함유량이 높을 때 깨끗해진 용해 물에 있는 plasmid DNA는 GeneAll®Exprep™Plasmid SV column에 있는 유리 극세사 막에 선택적으로 묶여진다. 묶인 plasmid DNA는 박테리아의 다른 요소의 요염을 제거하기 위한 washing 단계에서 정제된다. 결과적으로 낮은 농도의 염수나 탈 염수에 의한 용리는 유리 극세사 막으로부터 plasmid DNA를 방출한다. 이 간단한 방법이 유기 용매의 추출과 알코올 침전의 필요성을 제거해준다.

 <mini kit>

*실험 전에 알아두어야 할 사항

 -다른 설명이 없다면, 모든 원심분리과정은 상온에서 최대의 속도로 수행되어야 한다.

-처음 사용하기 전 RNase 용액을 buffer S1에 넣어준다.

-RNase를 추가한 후 S1은 4도에서 보관한다.

-새로운 1.5ml 또는 2ml tube를 준비한다.

-S2와 S3는 차가운 환경에서 침전될 것이다. 침전이 나타나면, 완전히 녹을 때까지 37도 물에 녹여야 한다.

실험과정

1) 밤새 배양한 박테리아 용액(5ml)에서 1ml을 파이펫을 이용하여 e-tube에 옮긴 후, 1분동안 10000xg의 속도로 원심분리한다. 원심분리 후 가라앉은 세포를 확인한 후 상층액은 버려주며, 다시 박테리아 용액 1ml을 넣고 원심분리와 상층액 제거를 반복한다 (5ml 모두 사용할 때까지)

2) S1 buffer 250ul을 넣어준 후 vortex 기계를 이용하여 세포를 완전히 풀어준다.

3) S2 buffer 250ul을 넣어주고, 아래위로 네 번 뒤집었다 세웠다 하면서 용액을 섞어준다. S2 buffer를 넣은 상태로 5분 이상 두면 안 되며, vortex도 절대 이용하지 않는다.

3) S3 buffer 350ul을 넣어 준 후 아래위로 네 번 뒤집었다 세웠다 하면서 섞어준다. vortex는 이용하지 않는다.

4) 10분간 13000rpm으로 원심분리한다.

5) 상층액을 SV column으로 옮겨준다. 이때 가라앉은 세포 찌꺼기들이 포함되지 않도록 조심한다.

6) 1분간 13000rpm으로 원심분리한 후, column을 열고 통과한 용액을 제거한 후, 다시 coulmn을 collection tube에 끼워준다.

7) 700ul의 PW buffer를 넣어준 후, 1분간 13000rpm으로 원심분리한다. column을 열고 통과한 용액을 제거한 후, 다시 coulmn을 collection tube에 끼워준 후, 1분간 13000rpm으로 원심분리를 한 번 더 해준다.

8) column을 새로운 e-tube에 끼워준 후, 50ul의 EB buffer를 넣어준다. 이때 EB buffer를 column의 중앙에 있는 membrane에 정확히 분주해주어야 하며, 파이펫 팁이 닿지 않도록 조심해야 한다.

9) 용액이 membrane에 흡수되어 DNA를 녹일 수 있도록 1분간 기다린 후, 1분간 13000rpm으로 원심분리한다.

10) 통과한 용액에 DNA가 포함되어 있으며, 전기영동을 통해서 확인할 수 있다.

                                  pAMP Plasmid Vector Map

211429_bit

조상환

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