염색체 DNA purification

Ⅰ. 실험목표

1) 브로콜리 및 구강상피세포에서 genomic DNA를 뽑아낼 수 있다.

2) gel electrophoresis를 통해 DNA를 확인하는 방법을 배운다.

3) DNA추출과 전기영동에 이용된 시약의 특성을 이해한다.

Ⅱ. 실험원리 및 개요

유전자에 대한 특성을 위해서는 1차적으로 클로닝 과정을 통해 특정 유전자를 확보하는 것이다. 유전자를 클로닝하기 위해서는 유전자를 운반할 vector 및 vector의 증폭에 이용될 숙주세포가 필요하다. vector에는 여러 종류가 있지만 매우 흔하게 이용하는 것이 plasmid이다. 플라스미드에 restriction enzyme과 DNA ligase를 이용하여 외부 DNA를 삽입한 후 숙주세포에 형질 전환 시켜 증폭하면 외부 DNA를 짧은 시간 내에 매우 많은 양을 얻을 수 있다.

제한효소는 세균바이러스의 증식을 막아주는 효소로 침입한 바이러스의 DNA를 절단하는 효소로 발견되어 바이러스의 증식을 제한 (restriction)한다하여 이름 붙혀졌다. 숙주 세포의 핵산분해효소 (제한효소)가 바이러스의 특정한 염기 배열을 인식하여 그 부위를 절단하여 바이러스의 게놈을 파괴한다. 제한효소는 특정한 염기 배열을 인식하여 그 염기 배열만을 절단하며 대략 4-8개의 염기배열을 인식하여 절단하는 제한효소가 일반적인 실험에서 유용하게 쓰인다.

제한효소는 자신이 인식하는 염기배열을 절단할 때 그림과 같이 돌출된 부분은 만들 수 있으며, 이들 돌출된 부분은 서로 상보적이기 때문에 다시 서로 수소결합을 통하여 결합하게 되며, 유전자 분리 및 재조합 DNA를 만드는데 이용되고 있다.

본 실험에서는 초파리와 구강상피세포에서 DNA를 추출해 보고, 전기영동실험을 통해 DNA를 확인해 보고자 한다.

Ⅲ. 실험재료

1) 실험 재료 : 구강상피세포 또는 브로콜리

2) 시약 : 생리식염수(구강상피), 70% Ethanol, 100% Ethanol, DNAzol, Agarose Gel, TAE buffer, DNA Stain(CarolinaBlu Stain or SafeshineBlue)

3) 기구 및 장비 : 전기영동장치, 고속원심분리기, 마이크로피펫, E-tube, UV Transilluminator, Conical Tube-15mL(구강상피), Pellet Pestle(초파리)

Ⅳ. 실험과정

<구강 상피세포 DNA 추출과정>

① 이온음료 또는 생리식염수로 입안을 강하게 헹궈서 상피세포를 추출하여, 15ml Conical tube에 담는다.

② 1.5ml씩 마이크로튜브에 옮겨 담은 후, 13000rpm의 속도로 1분간 원심분리한다. 이 과정을 3~5회 반복한다. (많이 할수록 수집하는 세포의 수가 늘어난다.)

③ 용액을 조심스럽게 따라 버린 후(조금 남김) DNAzol을 200ul 넣고, 볼텍스믹서 또는 피펫을 이용해서 용액과 세포가 잘 섞이게 한다. (세포가 튜브 아래 쪽에 있습니다.)

④ 원심분리기를 이용하여 10000 x g의 속도로 10분간 원심분리한다.

⑤ 상층액을 조심스럽게 새로운 튜브에 옮겨 담는다. (상층액에 DNA가 있다.)

⑥ 옮긴 tube에 100% ethanol을 조심스럽게 넣어주면(약 1mL) 층이 생기는 부분에서 하얀 실 같은 DNA를 볼 수 있다.
    만약 전기영동을 진행한다면, 다시 위아래로 뒤집어 내용물을 섞이게 해준다.

⑦ 원심분리기를 이용하여 13000rpm의 속도로 1분 동안 원심분리한다.

⑧ 상층액을 버린 후, 70% ethanol(약 1mL)을 넣어준 뒤 다시 13000rpm의 속도로 1분 동안 원심분리한다.

⑨ 상층액을 버린 후, 약 뚜껑을 열고 약 5분간 건조시킨다.

⑩ 증류수 30ul을 넣어 잘 녹여준다. 전기영동을 통해서 DNA를 확인한다.

<브로콜리 DNA 추출과정>

① 브로콜리를 최대한 잘게 부순 후 e-tube가 1/3 정도 찰 때까지 옮겨 담는다.

② DNAzol 200ul을 넣고, Grinder Motor 을 이용하여 더 충분히 갈아준다. 

④ DNAzol 300ul을 더 넣고, 위아래로 뒤집으며 내용물이 잘 섞이게 해준다.

⑤ 원심분리기를 이용하여 10000 x g의 속도로 10분간 원심분리한다.

⑥ 상층액을 조심스럽게 새로운 e-tube에 옮겨 담는다.

⑦ 옮긴 tube에 100% ethanol을 조심스럽게 넣어주면 층이 생기는 부분에서 하얀 실 같은 DNA를 볼 수 있다. 만약 전기영동을 진행한다면, 다시 위아래로 뒤집어 내용물을 섞이게 해준다.

⑧ 원심분리기를 이용하여 13000rpm의 속도로 1분 동안 원심분리한다.

⑨ 상층액을 버린 후, 70% ethanol을 넣어준 뒤 다시 13000rpm의 속도로 1분 동안 원심분리한다.

⑩ 상층액을 버린 후, 약 뚜껑을 열고 약 5분간 건조시킨다.

⑪ 증류수 100ul을 넣어 잘 녹여준다. 전기영동을 통해서 DNA를 확인한다.

<DNA 확인과정 : 전기영동장치 이용>

1. 1.0%가 되게 아가로즈를 TAE 완충용액에 넣고 전자레인지에서 녹인 후 콤이 꽂아진 겔 틀에 붓고 겔이 굳을 때까지 기다린다.

2. 굳은 겔을 전기영동장치에 넣고 겔의 홈이 잠길 때까지 완충용액을 붓는다.

3. 전원을 꼽고 DNA를 “-”에서 “+”방향으로 이동하도록 한다.

4. 약 30분 정도 지나면 전원을 끄고, 겔을 전기영동장치에서 빼내 자외선을 쪼아주면서 관찰한다.

<실험시 주의사항>

1. 실험재료는 반드시 신선하게 유지해야 유전물질의 파괴를 막을 수 있다.

2. 전기영동 기구를 사용할 때 높은 전압이 걸리므로 전기 안전에 유의한다.

Ⅴ. 실험결과 및 토의

1. 전기영동 결과를 첨부하고 설명하여 보자.

2. DNAzol 시약이 어떤 역할을 수행 할 것인지 생각해보자.

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