GeneAll® Exprep™ Plasmid Purification Kit

GeneAll®Exprep™Plasmid Kit는 박테리아세포로부터 소규모의 plasmid DNA를 준비할 수 있는 쉽고 빠른 방법을 제공한다. 이 kit는 어떠한 plasmid도 분리하고 정제할 수 있지만 plasmid가 20kb보다 작을 때 가장 효과적이다. [플라스미드 벡터맵]

순수한 plasmid를 준비하는 모든 과정은 25분 정도 걸리며 다양한 샘플들을 동시에 수행할 수 있다. 30ug까지의 순수한 plasmid는 mini kit로 정제될 수 있고 이 순수한 plasmid DNA는 더 이상의 조작 없이 PCR, 형광의 연속, 분류된 교배조사의 합성, 세포교환, 전기 천공법, 제한효소 분석에 사용된다.

Ⅰ. 실험원리

GeneAll®Exprep™Plasmid Kit는 한정된 알칼리성 용해방법에 기초한 유리 극세사 막을 활용한다. 알칼리성 용해는 박테리아의 세포로부터 온 plasmid DNA을 방출하고 RNA을 저하시키고 Rnase 용해물 안에 살아있는 어떠한 RNA라도 지운다. 세포의 잔해와 나트륨침전물은 mini kit에 원심분리에 의해 제거된다.

나트륨 함유량이 높을 때 깨끗해진 용해 물에 있는 plasmid DNA는 GeneAll®Exprep™Plasmid SV column에 있는 유리 극세사 막에 선택적으로 묶여진다. 묶인 plasmid DNA는 박테리아의 다른 요소의 요염을 제거하기 위한 washing 단계에서 정제된다. 결과적으로 낮은 농도의 염수나 탈 염수에 의한 용리는 유리 극세사 막으로부터 plasmid DNA를 방출한다. 이 간단한 방법이 유기 용매의 추출과 알코올 침전의 필요성을 제거해준다.

*실험 전 참고사항

-다른 설명이 없다면, 모든 원심분리과정은 상온에서 최대의 속도로 수행되어야 한다.

-처음 사용하기 전 모든 RMase 용액을 buffer S1에 더한다.

-RNase를 추가한 후 S1은 4℃에서 보관한다.

-새로운 1.5ml 또는 2ml tube를 준비한다.

-S2와 S3는 차가운 환경에서 침전될 것이다. 침전이 나타나면, 완전히 녹을 때까지 37도 물에 녹여야 한다.

Ⅱ. 실험과정

⑴ 정제된 용해물 준비

1. 원심분리기에서 10.000xg로 5분동안 원심분리에 의해 박테리아의 배양균을 작게 만들고, 표면에 뜨는 물질을 가능한 한 많이 제거한다.

박테리아 배양균의 적절한 부피를 사용해야 한다(높은 복제 개수의 plasmid는 5ml까지, 낮은 복제 개수의 plasmid는 10ml까지). 박테리아의 배양균은 선별된 항생제를 포함한 LB배지에 16~21시간 동안 배양되어야 한다.

TB나 2xYT 같은 또 다른 고농도 용액 또는 더 높은 배양균의 부피의 사용은 용해 효과를 저하시키거나 SV column에 과부하가 걸리게 할 수 있다.

최대의 속도로 1분 동안의 원심 분리에 의해 박테리아 세포는 1.5ml 또는 2ml micro tube에서 반복적으로 작아질 수 있다.

2. 작아진 박테리아 세포들은 S1 용액 250ul에서 자유로운 상태가 되며, 이 상층액을 새로운 1.5ml tube로 옮긴다.

세포 알갱이를 자유롭게 하는 건 필수이다. 만약 세포가 이전 단계에서 1.5ml tube안에 축소되었다면 그 부유액을 옮길 필요는 없다.

*처음 사용하기 전 모든 RMase 용액을 buffer S1에 더한다.

3. S2 250ul을 더하고 tube를 4번 뒤집어서 섞어라. (소용돌이치게 해서는 안 된다.)

- 세포 부유액을 깨끗하고 점성이 생기게 될 때까지 배양해야 한다. (5분 이상 배양하지 말 것.)

용해물이 탁한 덩어리 없이 깨끗하게 된 후에 즉시 다음 단계를 진행하는 것이 중요하다. 침전된 물질을 사용하기 전에 S2에서 만든다면, 37도에서 용해시키기 위해 데워라. 침전된 S2는 DNA 회복결과에서 상당한 감소를 야기시킬 것이다.

4. S3 350ul을 더해라. 그리고 즉시 tube를 4~6번 뒤집어서 섞어라. (소용돌이치게 해서는 안 된다.)

-더 좋은 침전물을 위해, S3를 추가한 후 용해물을 잘 섞어준다.

5. 10분 동안 원심분리를 한다.

⑵ plamid DNA의 분리와 정제

1. 부유물을 pipet이나 붓기에 의해 SV colunm에 조심스럽게 옮긴 후 30초동안 원심분리를 한다.

SV column을 없애고, 통과한 액체는 제거한 다음, SV column을 collection tube에 다시 넣는다.

- 하얀 침전물이 Sv column에 들어가지 않도록 유의한다.

2. (선택사항:) AW buffer 500ul을 넣고 30초 동안 원심분리를 한 후, SV column을 없애고 통과한 액체는 제거한다. 그리고 SV column을 collection tube에 다시 넣는다.

- 이 단계는 endA+ strain으로부터 뉴클리아제 활동의 어떠한 흔적을 지우는 것이 필요하다. 야생형과 어떠한 대장균 strain은 유전자 endA+에서 암호화되고 이중가닥의 DNA를 감소시키는 엔도뉴클레아제를 만들어낸다. 이 대장균 유전자 타입 endA1은 야생형 endA 유전자에서 돌연변이로 나타난다. 그리고 그것은 뉴클레아제를 비활성화시킨다.

이 돌연변이 상태의 대장균 strain은 endA-로 나타난다.

유전자형 목록에서 endA1의 부재는 야생형 유전자의 출현을 야기한다. 그리고 이 출현은 활성 엔도뉴클레아제1을 나타낸다. 야생형은 endA+로 나타내어진다. 몇 개의 대장균 가닥의 유전자형은 13페이지 표2에 나타나있다.

저농도의 복제 plasmid가 사용될 때, endA-를 무리하게 사용한다고 해도 이 단계를 수행하는 것은 강력하게 권장된다.

3. PW buffer 700ul을 넣고 30초동안 원심 분리한 후, SV column을 없애고 통과한 액체는 제거한다.

그리고 SV column을 collection tube에 다시 넣는다.

4. 잔여 wash buffer를 제거하기 위해 추가적으로 1분동 안 원심 분리한 후, SV colunm을 (사용하지 않은) 새로운 1.5ml tube에 옮긴다.

- 이 단계는 SV column 막으로부터 잔여 에탄올을 제거한다. 용출액에서 잔여 에탄올은 차후에 효소 반응을 억제할 수도 있다. PW buffer의 잔해가 야기되면, 다음 단계를 진행하기 전에 1분간 더 원심 분리한다.

5. EB 또는 중성의 증류수 50ul을 더하고 1분간 두었다가 1분간 원심 분리해라.

-EB 나 중성의 증류수가 DNA의 최상의 용리를 위한 회전 기둥 막의 중앙에 직접적으로 쓰여진다.

- 용리액의 부피는 최대 200ul까지 조정될 수 있다. 그리고 이것은 plasmid의 전체 추출량을 증가시키지만 용리의 농도는 감소시킨다. 더 높은 농도의 용리때문에, 용리액의 부피는 최소 40ul까지 감소 될 수 있다. 용출액의 부피는 용리액의 부피보다 작고 결과에 영향을 미치지 않을 것이다.

긴 보관을 위해서는, EB(10 mM TrisCl, pH8.5)안에서 용리하는 것과 –20도 이하에서 저장하는 것이 권장된다. 용리를 위한 물을 사용할 때, pH용액은 7.0~8.5범위에 있어야 한다.

더 큰 plasmid(10kb이상)는 보통 미리 데워진 EB(70도)나 ddH2O가 용리에 주입되지 않는다면 최대한으로 용리되어지지 않는다. 미리 데워진 용리 buffer를 추가한 후에 2분 동안 배양한다.

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