PCR 실험세트

Ⅰ. 실험 목표

· 중합 효소 연쇄 반응(PCR)의 원리와 실제 PCR이 무엇인지에 대한 실무 경험을 할 수 있다.

· PCR이 DNA를 증폭시키는 과정을 이해할 수 있다.

Ⅱ. 필수 핵심 질문

· PCR은 DNA를 어떻게 증폭하는가?

· PCR을 수행하는데 필요한 시약은 무엇인가?

· PCR은 어떤 종류의 문제에 답을 줄 수 있는가?

※ 표준 콘텐츠

- NGSS 정렬

HS-PS1 : 물질과 그 상호작용

PS1. A : 물질의 구조와 특성

HS-PS2 : 동작 및 안정성 : 힘과 상호작용

PS2. B : 상호작용 유형

HS-LS1 : 분자에서 유기체까지 : 구조와 과정

HS-LS3 : 유전 : 형질의 유전과 변이

LS3. A : 특성의 상속

과학 및 공학 관행

모델 개발 및 사용

데이터 분석 및 해석

크로스커팅의 개념

원인과 결과

구조와 기능

Ⅲ. 개요

1984년 Dr. Kary Mullis 는 분자 생물학 분야의 혁명을 일으켰다. 그는 특정 DNA 조각을 복사하는 간단한 방법을 거부했다.

세포핵에서의 DNA 복제의 초기 단계가 RNA 프라이머의 결합이라는 것을 인식하고, 짧은 합성 DNA 프라이머 및 DNA 중합 효소 I를 사용하여 시험관 내에서 DNA를 복제 할 수 있음을 발견했다.

더욱이, 연구자들이 특정 유전자를 표적으로 하기 위해 프라이머의 서열을 지정할 수 있기 때문에, 이 방법은 실험실에서 선택된 DNA 서열의 빠른 증폭을 가능하게 했다.

오늘날 중합 효소 연쇄 반응 (또는 PCR)으로 알려진 이 기술을 개발한 Mullis는 1993년 화학 부문에서 노벨상을 수상했다.

DNA를 증폭시키기 위해, 정제된 이중 가닥 DNA는 짧은 DNA 프라이머, 온도 조절이 가능한 DNA 중합 효소(Taq) 및 뉴클레오티드(nucleotides)와 혼합된다.

혼합물을 94℃로 가열하여 DNA를 "변형" 과정을 거쳐(즉, 수소 결합을 파괴함으로써 단일 스트래드로 압축 해제)이중으로 만든다.

다음으로, 샘플을 45℃ - 60℃로 냉각시켜 프라이머가 목표 DNA 시퀀스 (“가열이 냉각되는” 단계) 와 염기쌍을 이루게 한다.

마지막으로, 온도가 72℃로 올라가는데, 이 온도에서 중합 효소가 프라이머를 확장하여 새로운 DNA 가닥을 합성한다.

각각의 주기(변형, 가열냉각, 연장)는 목표 DNA의 양을 두 배로 증가시킨다 (그림 1).

"cycler" 또는 "PCR machine"이라고 불리는 전문 기계는 샘플을 빠르게 가열하고 냉각시키는 데 사용된다.

 PCR의 각 주기는 표본의 DNA 양을 두 배로 증가시킨다. (그림 2)

수학적으로, 이 2배는 지수 관계로 표현될 수 있다. 만약 우리가 m을 시작 카피 번호로 시작한다면, n 사이클 후에 우리는 DNA 대상의 m * 2ⁿ 카피를 가지게 될 것이다.

예를 들어, 대상의 복사본 하나부터 시작하면 첫 번째 PCR 주기 후 2번, 두 번째 PCR 주기 후 4번, 세 번째 PCR 주기 후 8번 등을 갖게 된다.

일반적으로, 20-40 사이클의 DNA 생산량은 고원이라고 알려진 최대치를 침전시킨다. (그림 2)

곡선에서 이러한 레벨링은 프라이머 및 뉴클레오티드와 같은 반응 성분의 고갈 및 Taq 중합 효소 활성의 손실에 기인한다.

PCR은 사용의 용이성과 DNA를 빠르게 증폭시키는 능력 때문에 의학 및 생명과학 실험실에서는 불필요한 존재가 되었다.

예를 들어, 오늘날의 연구소는 복제 응용 프로그램을 위한 특정 영역의 DNA 복사본을 빠르게 만들 수 있고, 의학 진단은 PCR을 사용하여 유전적 돌연변이와 전염성 물질을 식별할 수 있다.

또한, PCR에 의한 증폭은 시작 재료가 거의 필요하지 않기 때문에 생물 표본의 법의학적 분석이나 친자 확인에 이상적이다.

PCR이 수행된 후, 샘플에는 수백만 개의 DNA 조각이 포함되며, 이 혼합물을 분석하기 위해 agarose gel 전기영동 기술을 사용하여 크기에 따라 DNA 조각을 분리한다.

DNA 분자의 혼합물은 겔 내의 "웰"에 첨가되고, 이어서 전류가 겔을 통과한다.

DNA 가스의 인산염 백본은 강한 음전하이기 때문에 전류는 겔을 통해 DNA를 양극 쪽으로 유도한다. (그림 3A)

얼핏 보면, agarose gel은 상온에서 고체로 보인다.

분자 수준에서 그 겔은 DNA가 통과 할 수 있는 작은 통로를 가지고 있는데, 작은 DNA 조각은 이러한 구멍을 통해 쉽게 움직일 수 있지만, 큰 DNA 조각은 통로를 통과하기 어렵다.

크기가 다른 분자들은 서로 다른 속도로 이동하기 때문에 분리되어 겔 내에서 별개의 "밴드"를 형성한다.

전류가 멈춘 후에는 DNA에 달라붙는 얼룩을 사용하여 밴드를 시각화 할 수 있다. (그림 3B)

Ⅳ. 실험 전 평가

· 실험을 실행하기 전 다음 주제를 파악해야 한다.

1. DNA의 구조

a. DNA는 4개의 다른 뉴클레오티드로 구성된다.

b. 뉴클레오티드는 인산염 결합에 의해 연결된다.

c. DNA 가닥 수소 결합이 반 평행 방향으로 서로 결합된다.

2. 유기체 내 DNA의 기능

a. DNA는 유전자로써 유전 정보를 포함하고 있다.

b. 각 유전자는 단백질을 만들 수 있는 기본 성질이 들어있다.

3. PCR의 기초

a. PCR 주기 당 3단계

ⅰ. 변성 - 수소 결합을 끊어 DNA를 단일 가닥으로 분리한다.

ⅱ. 냉각 – 목표 DNA 시퀀스와 프라이머가 베이스 쌍을 이룬다.

ⅲ. 확장 - Taq 중합 효소가 프라이머를 확장하여 새로운 가닥의 DNA를 합성한다.

b. DNA의 지수 증폭 - 각 PCR주기는 샘플에서 DNA의 양을 두 배로 늘린다.

4. 전기영동에 의한 분석

a. agarose gel 전기영동은 DNA 조각을 크기별로 분리한다.

b. 겔에 사용된 agarose 백분율은 겔을 통한 DNA의 이동에 영향을 미친다.

ⅰ. 높은 비율의 겔은 작은 조각을 더 잘 분리한다.

ⅱ. 낮은 퍼센트 겔은 큰 조각을 더 잘 분리한다.

♣ 활동 1 : PCR 구현해보기

⑴ 필요 재료

· 팝 비즈 : 각 그룹은 색상 당 32개 이상의 비즈가 필요하다.

· 스톱워치 또는 타이머

· 디지털 카메라 또는 핸드폰 (옵션 사항)

⑵ 과정

① 각 그룹은 팝 비즈 세트를 받는다. 비즈는 아래에 기술된 바와 같이 색상별로 기본 명칭을 정해둔다.

red = adenine (A)

blue = thymine (T)

white = guanine (G)

yellow = cytosine (C)

② 구슬을 두 가닥으로 조립하여 DNA를 형성한다. 구슬의 끝은 5' 인산염을 나타낸다.

· 정방향 가닥 : 5'-ATAGGCACTGCCTAGT-3'

· 역방향 가닥 : 3'-TATCCGACGATCA-5'

③ 3세트의 DNA 프라이머를 조립한다.

· 정방향 프라이머 : 3'-TATCCG-5'

· 역방향 프라이머 : 5'-CCTAGT-3'

④ 두 DNA 가닥을 정렬한다.

⑤ PCR 수행 : (강사가 각 단계를 30-45초 간격으로 학생들에게 알려준다.)

· 94℃에서의 변성 : 두 개의 DNA 가닥이 분리된다.

· 45 - 60℃에서의 어닐링 : DNA 가닥에 대한 프라이머 어닐링

· 72℃에서의 확장 : taq 중합효소는 프라이머를 출발점으로 하여 DNA의 보완적인 가닥을 확장한다.

· a~c 과정을 두 번 더 반복한다.

⑶ 평가

· PCR의 3주기가 완료된 후 각 학생 그룹의 최종 결과를 확인한다.

· 학생들은 4개의 DNA 이중체 (8가닥의 DNA)를 가져야 한다.

· 학생들은 제출을 위해 최종 결과의 사진을 찍는다.

⑷ 토론

Taq 중합효소는 복사된 9,000개의 염기 당 하나의 실수가 나타나는 것으로 추정된다.

본인이 실행한 PCR 결과에 나타난 잘못된 점이 보이는가? 오류율이 얼마나 되는가?

- 답은 학생/그룹별로 다를 것이다.

2. DNA 템플릿의 한 복사본으로 시작한다고 상상해보자. PCR 10 사이클을 수행한 후, 샘플에 존재하는 DNA의 복사본은 몇 개인가?

20 사이클 후와 30 사이클 후도 예상해보자.

♣ 활동 2 : PCR 실행하기

학생들은 2~4명 정도로 그룹을 짠다.

⑴ 실험재료

· Edvotek kit #330 - PCR amplification of DNA

· 5-50ul 조절가능한 마이크로피펫

· 일회용 마이크로피펫 팁

· 열 싸이클러

· 전기 영동 장치

· 전력 공급 장치

· UV transilluminator

· 전자레인지

※ Edvotek kit #330 - PCR amplification of DNA

이 실험키트는 쉽고 간단하게 90분 만에 소량의 DNA를 수십억개 복사할 수 있다.

학생들은 스스로 증가하는 DNA를 보면서 매 사이클마다 샘플을 채취하여 DNA 겔로 분석할 수 있다.

10개 그룹이 사용할 수 있다.

⑵ 실험과정

실험을 수행하기 전에 올바른 실험 자세를 고지해야 한다. (개인 예방 장비, 장비 사용시 주의사항 등)

실험을 시작하기 전에 학생들은 다음을 수행해야 한다.

· 실험소개와 설명서를 주의 깊게 읽고, 그 정보를 사용하여 이 실험에 대한 가설을 세워본다.

· 실험 결과를 예측해본다.

실험하는 동안 학생들은 다음을 수행해야 한다.

· 모든 관찰 결과를 노트에 기록한다.

실험 후 학생들은 다음과 같은 질문을 해야 한다.

· 결과 해석 – 결과 데이터가 가설을 지지하는가, 모순되는가?

· 만약 위 실험이 반복된다면, 무엇이 변화될 수 있는가? 이러한 변화를 반영하여 가설을 수정해본다.

학생들은 노트에 모두 기록하고, 활동이 끝나면 공식적인 실험보고서를 작성하여 제출해야 한다.

⑶ 토론

PCR 샘플의 성분은 무엇인가? 각 구성 요소는 무엇을 나타내는가?

· 템플릿 – 복사하고자 하는 정제된 이중 가닥 DNA

· 프라이머 - 증폭을 위해 특정 DNA 서열을 목표로 하는 짧은 합성 DNA 분자

· Taq DNA 중합 효소-DNA 복사에 사용되는 열 안정성 효소

· 자유 뉴클레오티드 - DNA의 구성 요소

· 열 싸이클러 (PCR 기계) - 샘플을 빠르게 가열하고 냉각시키는 특수 기계.

2. Taq은 열 안정성 DNA 중합 효소이다. 왜 중요한가?

PCR에 의한 DNA의 증폭은 DNA 가닥 사이의 수소 결합을 변성시키기 위해 샘플을 94 ℃로 가열해야 하는데, 비분해성 DNA 중합효소와 달리, Taq DNA 중합효소는 고온에서 안정적이다.

따라서, 여러 PCR 주기를 통해 안정적인 효소 활동을 유지할 수 있다.

3. 실제로 PCR은 어떻게 응용할 수 있는가? PCR을 어디에서 사용할 수 있는가?

오늘날의 연구소는 복제 응용 프로그램을 위해 특정 영역의 DNA 사본을 신속하게 만들 수 있다.

의료진단은 PCR을 사용하여 유전자 돌연변이와 전염성 물질을 식별할 수 있으며, PCR에 의한 증폭은 시작 재료가 거의 필요하지 않기 때문에 생물학적 샘플의 법 의학적 분석 또는 친자 확인에 이상적이다.

학생들이 PCR을 어떻게 적용할 수 있는지 창의적으로 생각하는 시간을 가져보자.

♣ 중합효소(Polymerase)의 연쇄반응

중합효소 연쇄반응(PCR)은 연구자들이 원하는 DNA의 많은 복사본을 빠르게 만들 수 있도록 하는 기술이다.

PCR은 현재 질병 검진, 법의학 검사, 생물학 연구에 사용되고 있으며 학생들이 줄기 개념을 탐구할 수 있는 귀중한 플랫폼을 나타내고 있다.

Edvotek은 Edvocycler™와 MegaCycler™ 기계를 포함하여 매우 다양한 PCR 실험과 장비를 개발했다.

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