E.coli 형질전환 (PGAL)

Ⅰ. 실험 목적

· 플라스미드 DNA에 의한 박테리아 형질전환을 이해한다.

· 파란색의 박테리아 콜로니의 존재로 Lac+ 형질을 설명한다.

* 요약 설명

· 이 실험에서 학생들은 플라스미드 DNA와 함께 호스트 박테리아 세포를 변환한다. 형질전환 요인은 항생 물질에 대한 내성이 요구되고 파란색을 띄는 것은 베타 갈라토시다제와 암피실린 내성 유전자의 결합과 발현 때문이다. pGal이 베타갈라토시다제 유전자를 가지고 있기 때문에 IPTG는 필요하지 않다. 형질전환 요인의 수는 측정될 것이며 형질전환 효율 측정을 할 것이다.

Ⅱ. 안전 유의사항

▶ 보호 장갑 및 보호안경을 반드시 착용한다.

▶ 시약을 가열하거나 녹이는 장비를 다룰 때에는 특별히 주의해야 한다.

▶ 입으로 피펫을 사용하지 않는다. 피펫 펌프, 벌브, 마이크로피펫을 사용한다.

▶ 전기 장비를 사용할 경우 각별히 조심한다.

- 전기영동장치의 뚜껑을 벗기면 전원 공급 장치로부터 나오는 전기 전류는 자동으로 차단되지만,

먼저 전원을 빼고 플러그를 뽑은 후 전선을 분리하고 뚜껑을 벗긴다.

- 사용하지 않을 때는 전원을 끄고 플러그를 뽑는다.

▶ 전기영동 실험 장치는 전기가 새어 나가는 틈이 없다. 그러나 만약에 실험 중 전기가 샌다고 생각이 들면 즉시 전원을 차단하고 사용을 중단한다.

▶ 항상 시약이나 생물학적 물질을 다루는 실험이 끝나면 비누로 손을 깨끗이 씻는다.

Ⅲ. 준비사항

⑴ LB Agar 플레이트 준비하기

 ⑴ 고체의 ReadyPour LB Agar를 힘있게 누르고 흔들어 작은 조각으로 부순다.

⑵ 뚜껑을 모두 열어 빼지 말고 살짝만 열어 가열되는 동안 수증기가 빠지지 않게 한다.

⑶ 전자렌지에 넣고 60초간 작동시켜 Agar를 녹이고 조심스럽게 꺼내어 병을 살살 돌려준다. 다시 30초간 전자렌지에 넣

고 돌려 열을 가한다. 이 과정을 아가가 완전히 용해될 때까지 반복한다.

⑷ 투명할 정도로 다 용해가 되었다면 60도까지 식혀준다.

⑸ 식는 동안 20개의 페트리디쉬에 네임펜으로 줄을 그어 표기를 한다. 나중에 X-Gal/Amp 로 표기될 페트리 디쉬이며, 10개는 X-Gal/Control로 표기될 것이다.

⑹ 식힌 Agar 20ml씩 다섯 개의 페트리 디쉬에 각각 넣는다.

⑺ X-Gal 용액을 해동시켜 식힌 ReadyPour Agar에 넣는다. 병 뚜껑을 다시 닫고 흔들어서 섞는다.

⑻ 5ml 아가를 X-Gal/Control 1 에 넣는다.

⑼ Ampicillin 모두를 남아 있는 ReadyPour Agar 병에 넣는다. 뚜껑을 다시 닫고 흔들어서 섞는다.

⑽ 5ml의 X-Gal/Amp을 X-Gal/Amp로 표기한 20개의 페트리디쉬에 첨가한다.

⑾ 뚜껑을 닫고 최소 20분을 기다려 LB-Agar가 굳게 한다. 페트리디쉬를 상온에서 하루 정도 다음날까지 놔준다.

⑿ 이틀 이상 상온에 두지 않도록 하고 완전히 마르지 않도록 뒤집어 놔야 한다.

주의 : 만약 사용하기 이틀 이상 전에 미리 만들어 놓는다면 뒤집어서 냉장 보관을 해야 한다. 그리고 사용 바로 전 30분 정도 37도의 인큐베이터에 두어야 한다.

⑵ E.coli 소스 플레이트 준비

최상의 결과를 위해 E.coli 소스 플레이트는 실험 16-20시간 전에 스트리킹을 해야 한다.

⑴ 멸균된 루프를 사용해 바이알에서 BactoBead를 떼어낸다. LB 소스 플레이트의 끝부분에 옮긴다. 사용 후 바이알 뚜껑은 즉시 닫는다.

⑵ 10ul의 멸균된 물을 첨가하여 용해 시킨다.

⑶ 용해된 BactoBead를 아래 위로 스트리킹한다. 이때 배지에 구멍이나 찢어짐이 생기지 않도록 한다.

⑷ 다른 방향으로 스크리킹 한다.

⑸ 페트리디쉬를 돌려가며 각 여러 방향으로 스트리킹 한다.

⑹ 뚜껑을 덮어 37도에서 16-20시간 배양한다.

⑺ 각각의 LB 소스 플레이트도 위의 과정처럼 한다.

Ⅳ. 실험과정

⑴ 한 개의 원심분리기 튜브에 “+DNA”를 표기하고 다른 하나의 튜브에는 “-DNA”를 표기한다.

⑵ 500ul의 차가운 CaCl₂ 용액을 –DNA 튜브에 넣고 1ml 피펫으로 섞어준다.

⑶ 이쑤시개를 이용해 약 1-1.5mm 크기의 콜로니 15개 정도를 “-DNA”튜브에 옮긴다.

⑷ 이쑤시개를 돌려가며 잘 풀어준다. 볼텍스가 있으면 이용해 용액에 잘 녹도록 섞어준다.

⑸ 그 중에서 250ul를 +DNA 튜브로 옮겨 넣고 얼음 위에 놓는다.

⑹ 10ul의 pGal을 +DNA 튜브에 넣고 10ul의 컨트롤 버퍼를 –DNA 튜브에 넣는다.

⑺ 10분간 얼음 위에서 배양한다.

⑻ 두 개의 튜브를 90초 동안 42도의 항온수조에 넣는다.

⑼ 다시 얼음 위에 튜브를 놓고 2분을 기다린다.

⑽ 250ul의 Recovery Broth를 각 튜브에 넣고 피펫으로 섞는다.

⑾ 37도의 항온수조에서 30분간 배양한다.

⑿ 그동안 아가 플레이트에 다음 세 가지를 적는다.

X-Gal/Control 1 (no stripe)

Amp/X-Gal/Control 2 (one stripe)

Amp/X-Gal/pGal (one stripe)

⒀ 튜브를 항온 수조에서 빼내 실험대 위에 놓는다.

⒁ 피펫으로 250ul 만큼 –DNA 튜브에서 빼내 X-Gal/Control 1 페트리디쉬와 Amp/X-Gal/Control 2 페트리디쉬에 넣는다.

⒂ 250ul를 +DNA 튜브에서 빼내 Amp/X-Gal/pGal 페트리디쉬에 넣는다.

⒃ 루프를 사용해 전체적으로 균일하게 도포한다. -DNA 샘플과 +DNA샘플에 사용하는 루프는 다르도록 주의한다. 뚜껑을 덮고 5분간 기다려 아가에 세포가 흡수되게 기다린다.

⒄ 페트리디쉬를 쌓아 테이프로 묶는다. 실험한 조를 표기하고 뒤집어서 37도 인큐베이터에 넣고 16-20시간정도 배양한다. 만약 인큐베이터가 없으면 24-48시간동안 실온에 놔두도록 한다.

⒅ 각 페트리디쉬를 관찰하고 다음의 결과를 적는다.

·콜로니의 수

·박테리아의 색

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