그람염색을 통한 세균관찰

Ⅰ. 서론

세균은 크기가 매우 작기 때문에 많은 개체가 모여 군체를 형성한다. 그리고 광학 현미경으로 개체의 특성을 관찰하려면 특수한 염색이 필요하다. 그람양성 세균은 크리스탈 바이올렛 등의 염기성 염료로 염색되어 탈색제 처리 후에도 탈색되지 않고 보라색을 나타내는 세균이다. 그람음성 세균은 탈색제에 의해 크리스탈바이올렛이 탈색되고 대응 염색제에 의해 염색되어 붉은색을 나타내는 세균이다. 우리 주변에서 배양한 세균이 어떤 세균인지 그람 염색법을 통해 확인해 보자.

Ⅱ. 실험목표

⑴ 세균을 염색하여 그 모습을 관찰할 수 있다.

⑵ 그람 염색법을 사용하여 배양한 세균이 그람양성 세균인지 그람음성 세균인지를 구별할 수 있다.

Ⅲ. 실험재료

현미경, 슬라이드글라스, 커버글라스, 루프, 분젠버너, 스포이트, 거름종이, 시험관 집게, 성냥, 배양된 세균, 증류수, Crystal violet 용액 , Gram's Iodine 용액, 탈색제(아세톤-에탄올), 샤프라닌염색액

Ⅳ. 실험과정

① 슬라이드 글라스를 알콜로 깨끗이 닦아 지방을 제거한다.

② 슬라이드 글라스 위에 멸균 생리식염수 한 방울을 떨어뜨린다.

③ 한천 배지에서 18-24 시간 배양한 균을 백금이로 소량 따서 슬라이드 글라스 위의 생리 식염수에 잘 푼다.

④ 공기 중에서 건조시킨다.

⑤ 알콜 램프 위를 3-4회 통과시키면서 불꽃에서 건조 고정한다.

⑥ Crystal violet 염색약으로 염색한다. 약 1분간 방치한다.

⑦ 슬라이드 뒷면으로 수돗물을 흐르게 하여 조금씩 씻는다. iodine 용액을 충분히 가하고 약 1분간 반응시킨다.

⑧ 탈색제로 에탄올을 사용하여 충분히 탈색시킨 다음 흐르는 물로 탈색제를 씻어낸다.

⑨ 대조 염색으로 safranin O 용액을 가하고 약 30초간 염색한다.

⑩ 흐르는 물로 염색액을 씻어내고 건조시킨 다음 현미경으로 그람염색성을 관찰한다.

Ⅴ. 실험결과 및 토의

⑴ 결과 및 분석

① 그람양성균은 그람염색법에 의하여 자주색(보라색에 가까운 파란색)으로 나타난다.

② 그람음성균은 그람염색법에 의하여 자주색은 탈색되고 사프라닌으로 붉게 염색된다.

⑵ 토의

① 그람염색법에 의해 관찰한 결과를 그림으로 그려보자.

② 현미경으로 관찰한 세균은 그람양성인가 아니면 음성인가?

③ 그람염색법에서 에탄올에 의해 탈색되는 세균은 어느 것인가?

④ 세균 염색법의 종류와 방법 및 원리에 대해 조사해보자.

⑤ 그람양성균과 음성균의 차이점에 대해 조사해보자.

Ⅵ. 참고자료

⑴ 그람염색의 원리

     그람양성균은 염색한 세균을 알코올 같은 탈색제로 탈색하여도 크리스탈 바이올렛 또는 메틸 바이올렛-요오드 복합물이 세포 속에 그대로 머물러 있게 된다. 

     그 반대로 그람 음성균은 염색한 후 알코올에 의하여 완전히 탈색된다.

   색소-요오드 복합물을 탈색액으로 처리했을 때 그대로 균체 안에 머물러 있게 하는 것은 세포벽의 역할이다. 이 염색법은 기술이 미숙하면 잘못 판정하기 쉬우므로 숙련될 때까지 많은 연습이 필요하다. 

   또 어린 배양균은 염색성이 좋으나 노쇠기 배양균은 염색성이 좋지 않아 그람양성균이 음성균같이 보일 때가 많으므로 주의하여야 한다.

⑵ 세균의 분류

    세균은 세포벽을 가지는데, 세포벽의 구성성분 중 하나인 펩티도글리칸은 진핵생물의 세포벽에는 없는 물질이다.

    세균 중에는 세포벽의 펩티도글리칸 층이 두꺼운 것과 얇은 것이 있는데, 두꺼운 펩티도글리칸 층을 가지는 세균은 그람염색을 할 때 사용하는 크리스탈 바이올렛을 세포벽이 흡수하여 탈색 후에도 보유 하므로 보라색을 나타낸다.

   반면에, 펩티도글리칸 층이 얇은 세균은 단백질로 된 외피에 싸여 있어서 크리스탈 바이올렛을 함유하는 능력이 약하기 때문에 알코올에 의해 보라색은 탈색되고 나중에 사용되는 사프라닌에 의해 붉은색을 나타낸다. 세포벽이 두꺼운 그램 양성세균은 페니실린에 대해 매우 민감하다. 이것은 페니실린이 세포벽의 주성분인 펩티도글리칸 합성 효소의 작용을 억제하여 세포벽의 생성을 저해하기 때문이다. 이에 비해 그램 음성세균은 세포벽에 단백질 외피가 있어서 페니실린에 민감하지 않으며, 단백질 외피 생성을 억제하는 스트렙토마이신에 민감하다.

⑶ 그람 염색법

   덴마크의 세균학자 Christian Gram은 1884년 Gram 염색법에 의하여 세균을 크게 Gram 양성균과 Gram 음성균으로 분류했다. 

   Gram 염색의 주된 원리는 확실히 밝혀지지 않았지만 현재 가장 일반화된 이론은 Gram 양성균의 세포벽에는 Magnesium ribonuclate라는 산성물질이 있어 염기성 염료인 crystal violet와 결합하여 알코올에 탈색되지 않고 자색(violet color)으로 염색되고 그람 음성균의 세포벽에는 magnesium ribonuclate가 없어 탈색제인 알코올에 의해 탈색된 후 대조 염색인 safranin O에 의해 적색으로  염색된다. 그람 요오드 용액은 매염제로 사용되며 crystal violet이 magnesium ribonuclate와의 결합을 촉진시켜주는 역할을 한다. 

   그람 염색과 같은 감별 염색방법은 세균학적 측면에서 매우 중요한 기술 중의 하나이다.

(4) 현미경 관찰 사진(원핵생물 슬라이드표본 세트)

Bacillus. Gram-Positive (×800)

Bacillus. Gram-Negative (×800)

Bacteria & Yeast. (×400)

Bacterial Flagella. (×800)

Coccus. (×800)

Streptococcus. (×800)

Escherichia. coil (×800)

Spirillum. (×800)

Copyright (C) 2020 Biozoa All Rights Reserved